I radicali liberi dell’ossigeno (reactive oxygen species – ROS) sono specie molto reattive che danno origine a reazioni a catena
in grado di automantenersi e amplificarsi. Il fumo di sigaretta rappresenta una formidabile sorgente di ROS (1015 per aspirata,i quali si possono suddividere in due differenti gruppi: radicali a lunga emivita nella fase corpuscolata (fase tar) e radicali a
breve emivita nella fase aeriforme (fase gas). Essi contribuiscono a rendere il fumo di sigaretta un carcinogeno completo, dal momento che può agire sia come iniziatore che come promotore. La strategia terapeutica e preventiva pertanto deve essere volta ad aumentare le difese antiossidanti degli organi colpiti, in modo da ristabilire l’equilibrio tra ossidanti ad antiossidanti a favore di questi ultimi.Numerosi agenti sono attualmente allo studio, ed in questo ambito la sostanza più promettente risulta essere la N-acetil-L-cisteina (NAC), che in numerosi studi in vitro, sugli animali e recentemente anche sull’uomo, si è dimostrata in grado di ridurre e prevenire il danno genotossico indotto dai ROS del fumo di tabacco.
Introduzione
Il fumo di sigaretta rappresenta una importante sorgente di radicali liberi sia nella sua componente gassosa (fase gas) che corpuscolata (fase tar). Essi contribuiscono a rendere il fumo di sigaretta un carcinogeno completo, dal momento che può agire sia come iniziatore checome promotore della carcinogenesi. I
radicali liberi infatti non agiscono solo
danneggiando direttamente l’epitelio
polmonare,ma possono anche modificare il DNA, inducendo mutazioni che comportano un aumento del potenziale neoplastico (32).
I ROS e il danno genotossico polmonare prodotto dal fumo di tabacco
I radicali liberi dell’ossigeno (reactive oxygen species – ROS) sono atomi e molecole che possiedono un elettrone spaiato nell’orbita esterna ed includono l’anione superossido (O2), il radicale idrossile (OH) e il radicale perossidrile (HO2); iperossido d’idrogeno (H2O2) e gli acidi ipoalosi, come l’acido ipocloroso
(HOCl),non sono ROS ma vengono classificati come tali, in quanto derivano dall’ossigeno e prendono parte alla tossicità dell’ossigeno. Esistono inoltre anche altri metaboliti derivati dall’ossigeno, come l’ossigeno singoletto, l’ozono e i radicali perossili (R-Oo ) ed alcossili (R-O.)
I radicali liberi esplicano la loro azione tossica solo quando sonGli organismi aerobi infatti sono dotati
di valide difese antiossidanti che bilanciano la produzione radicalica legata al metabolismo di sostanze endogene ed esogene: esiste quindi un equilibrio tra sostanze ossidanti ed antiossidanti; lostress ossidativo può essere definito quindi come una aumentata esposizione agli ossidanti e/o una ridotta capacità di difesa degli antiossidanti
Con il termine di antiossidante si definisce qualunque sostanza che, presente in basse concentrazioni rispetto alle concentrazioni di un substrato ossidabile, ritarda o previene in misura significativa l’ossidazione del substrato in questione. Il termine “substrato ossidabile” comprende quasi tutto ciò che si trova nelle cellule viventi, comprese le proteine, i lipidi, i carboidrati e il DNA (1).
Il fumo di sigaretta contiene concentrazioni di ROS estremamente elevate, in grado di deteriorare il patrimonio di agenti antiossidanti contenuti nelle cellule epiteliali del parenchima polmonare
attraverso meccanismi legati all’aumentato stress ossidativo. o prodotti con una velocità o in una quantità tale da non poter essere inattivati dai sistemi di difesa cellulare.
. Inoltre l’abitudine al fumo di sigaretta determina un incremento del numero di polimorfonucleati
neutrofili (PMN) nel fluido broncopolmonare e i particolati del fumo possono attivare queste cellule; l’attivazione metabolica dei PMN porta così alla produzione di abbondanti quantità di anione superossido (2,3,4). In più il materiale estratto dal catrame contenuto nel fumo si è dimostrato in grado di produrre perossido d’idrogeno (5,6). Pryor e Coll. hanno identificato nel fumo di sigaretta due differenti gruppi di
radicali liberi: radicali a lunga emivita nella fase corpuscolata (fase tar) e radicali ad emivita breve nella fase aeriforme (fase gas). Il principale radicale della fase tar è costituito dal complesso chinoneidrochinone (10
17spin/g), un sistema redox molto attivo e in grado di ridurre l’ossigeno molecolare a radicale superossido equindi a perossido di idrogeno e a radicale idrossilico. La fase gas del fumo di sigaretta contiene invece una gran quantità di piccoli radicali alchilici e alcossilici (10 15-18 per aspirata di fumo di sigaretta) dotati di una reattività di gran lunga superiore ai radicali della fase corpuscolata (7, 8, 9, 31, 39).Il fumo di sigaretta contiene inoltre numerosi composti cancerogeni, quali idrocarburi aromatici policiclici (PAH), diidrobenzeni, N-nitrosamine, amine eterocicliche, Polonio 210, aldeidi e appunto i ROS (10).Recentemente è stato evidenziato da più parti che i ROS sono coinvolti sia nell’iniziazione che nella promozione e/o progressione della carcinogenesi chimica(32).
Il perossido d’idrogeno è infatti in grado di indurre metaplasia squamosa in un modello colturale di trachea di criceto.Visto che la metaplasia squamosa è associata allo sviluppo del carcinoma broncogeno, la presenza di perossido d’idrogeno nel fumo di tabacco può rivestire un ruolo rilevante per le sue proprietà carcinogeniche (11). Inoltre il condensato di fumo di sigaretta, ed in primo luogo la frazione acida che contiene diidrobenzeni quali l’idrochinone e il catecolo (o pirocatechina), si è rivelato essere direttamente mutageno,portando alla inattivazione di geni soppressori importanti nella carcinogenesi polmonare (12).
I ROS sembrano essere in definitiva un importante fattore nella carcinogenesi indotta dall’infiammazione: l’attivazione dei PMN e dei macrofagi dà origine ad una aumentata produzione di anione superossido, che può portare alla formazione di perossido d’idrogeno, che si dissocia quindi in radicale ossidrile (15, 32,39)
Le difese antiossidanti del polmone
Le difese antiossidanti sono incentrate sul sistema del glutatione, che rappresenta il principale donatore tiolico intracellulare a basso peso molecolare; questo tripeptide è caratterizzato da un gruppo tiolico e da un legame peptidico gammaglutamilico peptidasi-resistente. Il pool cellulare del glutatione è il risultato di un equilibrio dinamico fra la sua sintesi ed il turnover correlato; quest’ultimo consiste principalmente nella liberazione di glutatione ridotto (GSH) della cellula (14). Il GSH svolge un ruolo importante nei
meccanismi di detossificazione e nella protezione delle cellule contro gli ossidanti. La rimozione dei ROS viene catalizzata dalla GSH-perossidasi, che utilizza come substrato il GSH; quest’ultimo viene rigenerato dalla forma ossidata (GSSG) per azione della GSH-reduttasi con il NADPH, i cui livelli vengono mantenuti dal ciclo dei pentoso-fosfati (15)
Nel polmone esistono diversi meccanismi antiossidanti intracellulari ed extracellulari di difesa, destinati al mantenimento della normale funzionalità cellulare polmonare. Il muco respiratorio possiede proprietà antiossidanti che forniscono uno schermo protettivo contro il fumo di sigaretta e i polluttanti atmosferici.
La SOD, la catalasi e la GSH-perossidasi sono i principali sistemi di difesa antiossidante intracellulare che eliminano i radicali anione superossido, perossido d’idrogeno e gli idroperossidi lipidici(15).
Il mantenimentodi un bilancio adeguato dei livelli intracellulari di GSH è critico per il sistema di difesa antiossidanteLa mancanza di precursori,principalmente di L-cisteina, può provocare uno squilibrio del delicato sistema di difesa intracellulare (15).
Strategie terapeutiche e preventive
La prevenzione primaria dei tumori e dialtre patologie legate a mutazioni genetiche si basa su due strategie complementari:
1. la possibilità di evitare l’esposizione ai fattori di rischio riconosciuti, come ilfumo di tabacco
2. il potenziamento delle difese dell’ospite tramite misure chemiopreventive
Diversi studi sono stati condotti e sono in corso per ricercare sostanze, somministrabili giornalmente o per determinati periodi, che siano in grado di limitare,annullare o prevenire l’azione mutagena e quindi cancerogena dei ROS.
Una farmacoterapia antiossidante dovrebbe idealmente disporre di farmaci ad azione specifica. Gli antiossidanti agiscono bloccando le reazioni avviate dai radicali, ma non sono in grado di distinguere tra radicali con ruoli fisiologici e radicali dannosi; è pertanto necessaria cautela nell’impiego degli antiossidanti
poiché questi composti non sono dotati solo di attività antiossidante,ma secondo Bast potrebbero agire anche come proossidanti (16).
Per esempio un antiossidante riconosciuto come il GSH, appartenente algruppo dei tiolici (SH),può manifestare in certe condizioni attività pro-ossidante. In modelli sperimentali, l’attività pro-ossidante del gruppo SH del GSH può spiegarsi facilmente sulla base della riduzione del Fe2+, ed è stata ipotizzata anche laformazione di ROS (16):
GSH + R→GS+ RH
dove:
GSH = glutatione ridotto R= specie radicalica GS= radicale tiilico RH = specie radicalica ridotta
Il radicale tiilico (GS) può reagire con l’ossigeno:
GS+ O2 →GSOO dove: GSOO= radicale perossilsulfenile
Le reazioni finali, in cui il radicale perossilsulfenile (GSOO.) reagisce con un secondo radicale, formano ossigeno che può trovarsi allo stato di ossigeno singoletto:
GSOO+ GSOO→GSSG + 2 O2
dove:
GSSG = glutatione ridotto
Va comunque sottolineato che il lavoro di Bast è l’unico presente in Letteratura a mettere in evidenza questo ruolo potenzialmente pro-ossidante, in certe condizioni, degli antiossidanti.
N-acetil-L-cisteina
In ambito chemiopreventivo la N-acetilL-cisteina (NAC), molecola appartenente al gruppo dei donatori tiolici, risulta essere uno degli agenti protettivi più promettenti.
La NAC è un agente mucolitico utilizzato nella bronchite cronica e nella fibrosi cistica sin dagli anni ‘60, oltre che come antidoto per la intossicazione da acetaminofene; più recentemente l’utilizzo della NAC è stato proposto per prevenire o attenuare la tossicità polmonare da ROS e anche nel trattamento della Sindrome da Distress Respiratorio Acuta (ARDS), della sintomatologia similinfluenzale e delle malattie ostruttive
croniche polmonari (17).
L’azione chemiopreventiva della NAC è legata alle sue proprietà nucleofiliche ed antiossidanti; la NAC infatti è in grado attraversare facilmente la membrana sarcolemmatica ed essere secreta nei liquidi bronchiali, e viene utilizzata dall’organismo come analogo della cisteina e come precursore del GSH, così da aumentare
l’attività della glutatione-S-transferasi,della GSH-perossidasi, della GSH-reduttasi, della NADH- NAD(P)H-chinonereduttasi; probabilmente essa è anche ingrado di promuovere la riparazione del
DNA proteggendo l’attività della ADPribosiltransferasi (18,19).Dal punto di vista biochimico la NAC
agisce sulle reazioni biologiche coinvolgono i ROS in due modi:mediante il suo gruppo sulfidrilico ridotto e mediante il metabolismo del gruppo idrossilico del glutatione (L-γ-glutamil-L-cisteina-glicina,GSH) (20).
Il risultato pratico è l’aumento delle riserve di glutatione, sia all’interno delle cellule che nel plasma, il che permette di fronteggiarne l’aumentato fabbisogno in situazioni di stress ossidativo.
In un recente studio multicentrico di Van Shooten e Coll., in doppio cieco e placebo-controlled, la NAC è stata somministrata per os (2 x 600mg/die) per un periodo di 6 mesi a 21 fumatori sani, nei quali sono stati misurati i livelli dei marker di dose interna (cotinina plasmatica e nel BAL, mutagenicità urinaria), dei marker di dose biologicamente efficace (DNA-addotti correlati al fumo, danno ossidativo del DNA ed addotti di emoglobina) e dei marker di risposta biologica (frequenza dei micronuclei e capacità scavanger degli antiossidanti) sia preche post-trattamento (17).
La somministrazione di NAC ha significativamente inibito la formazione deiDNA addotti nelle cellule del BAL (rilevati con spettrofotometria a fluorescenza sincrona),ma non gli addotti dell’emoglobina (Hb) e PAH-DNA; ciò può essere dovuto al fatto che la NAC viene deacetilata a L-cisteina in quei tessuti che possiedono
i necessari requisiti metabolici per la deacetilazione, determinando così un notevole aumento della biosintesi del GSH;così avviene per le cellule del BAL, che sono capaci di deacetilare e metabolizzare gli agenti xenobiotici, e presentano anche una maggiore sensibilità e accessibilità agli agenti contenuti nel fumo di
sigaretta che inducono la formazione di addotti (17).
Risultati simili sono stati riportati anche in studi sugli animali: la NAC, somministrata per os, ha attenuato la formazione di DNA addotti nel polmone, cuore, reni ed aorta di ratti esposti su tutta la superficie corporea al fumo di sigaretta (18, 19); la NAC inoltre ha determinato un incremento del metabolismo epatico degli agenti mutageni negli stessi animali (21).
Anche dopo che il DNA è stato danneggiato è possibile esercitare effetti protettivi, attraverso la modulazione della replicazione del DNA e dei processiriparativi.Questo delicato intervento può
essere realizzato rallentando la proliferazione cellulare, in modo da lasciare tempo sufficiente per la riparazione del DNA, aumentando la fedeltà della replicazione del DNA, inibendo i meccanismi di riparazione più esposti ad errori e stimolando la riparazione e/o la reversione del danno al DNA I tioli, e tra di essi in particolare il GSH,la NAC, il ditiotreitolo, il ß-mercaptoetanolo e l’_-mercaptopropionilglicina, esercitano un effetto protettivo in vitro sul DNA di epatociti in coltura, nei confronti dell’attività lesiva esercitata da radiazioni
X (22).La combinazione di NAC (1000 mg/kg/die) con Oltipraz (un analogo dell’ 1,2-ditiole-3-tione, usato in passato nel trattamento nella schistosomiasi)(400 mg/kg/die), in un altro studio dagli stessi Autori, è risultata particolarmente efficace nell’inibire la formazione di DNA addotti nel polmone ed Hb-addotti in un gruppo di ratti esposti per 28 giorni consecutivi su tutta la superficie corporea al fumo di tabacco (23).
Quando un composto del selenio (esbelen), che si comporta come la GSHperossidasi, ma in modo non specifico riguardo al substrato, viene somministrato insieme alla NAC, consentendole così
di agire in modo simile al GSH, si osserva un potenziamento degli effetti antiossidanti della NAC stessa (20).
Tutti i dati disponibili forniscono buone evidenze che la NAC possa rappresentare uno strumento concretamente utile nella chemioprevenzione del cancro polmonare e probabilmente di altre patologie che presentano analoghi meccanismi patogenetici, quali alcune patologie cardiovascolari.Sebbene al momento non vi siano ancora evidenze sufficienti per un suo uso estensivo nella popolazione generale, soprattutto exfumatrice, potrebbero tuttavia essere presi in considerazione dei trial clinici al dosaggio di 1200 mg/die nei soggetti ad alto rischio,come gli ex forti fumatori.
Sono da ricordare anche alcuni studi condotti su animali, che hanno dimostrato un promettente ruolo della NAC nel prevenire la carcinogenesi polmonare indotta dall’uretano (etilcarbamato) (34),dalla doxurubicina (35), dall’estratto di fumo di sigaretta (36) e dl benzopirene (37). In quest’ultimo studio, l’azione chemiopreventiva della NAC si esercitava mediante la formazione di coniugati con i fenitil-isoticianati (glusosinilati presenti nelle verdure crocifere). Questa osservazione è stata recentemente confermata da un altro studio, che ha suggerito una favorevole interazione anche con il miositolo in un modello murino di cancro polmonare indotto dal benzopirene(38).
5,6-benzoflavone e fenitil isotiocianato
Il 5,6-benzoflavone è un flavonoide sintetico che interagisce con il recettore Ah,un fattore di trascrizione che controlla l’espressione del citocromo P4501A1 (CYP1A1); Il 5,6-benzoflavone è un induttore delle
fasi I (reazioni di ossidazione: che introducono nella molecola del farmaco nuovi gruppi idrofili e/o protidici) e II (reazionidi idrolisi: che liberano detti gruppi idrofili da eteri, esteri, ammidi, acetali, emiacetali, epossidi) del metabolismo degli
xenobiotici,mentre il fenitil isotiocianato,come gli altri isotiocianati organici, inibisce gli enzimi della fase I coinvolti nella attivazione dei carcinogeni ed attiva allo stesso tempo gli enzimi di fase II che accelerano la rimozione cellulare dei carcinogeni attivati (18).Tale effetto è stato dimostrato anche nei confronti di composti
tipici del fumo di sigaretta, come la nitrosamina 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanone (24).
Il fenitil isotiocianato e il 5,6-benzoflavone, inoltre, somministrati entrambi alla dose di 500 mg/kg/die ai ratti esposti al fumo di tabacco, hanno mostrato un significativo effetto protettivo verso tutti i marker di danno genotossico misurati:danno ossidativo al DNA polmonare e DNA-addotti nelle cellule del BAL, nell’epitelio tracheale, nel polmone e nel cuore(18).
α-tocoferolo acetato ed acido ascorbico
In un recente studio il trattamento per via orale con α-tocoferolo (100 mg/kg) 1 ora prima della inalazione di fumo di tabacco in un gruppo di topi ha ridotto in maniera significativa a livello del polmone la formazione di DNA-addotti.Il pre-trattamento con a-tocoferolo per 5 giorni consecutivi (100 mg/kg/die) e anche quello con acido ascorbico (agli stessi dosaggi) ha completamente prevenuto la formazione di DNA-addotti a livello del polmone, stomaco e fegato (24).
Polifenoli del tè verde
L’effetto dei polifenoli del tè verde (GTP)sulla formazione di DNA-addotti e di prodotti della perossidazione lipidica (LLP) è stato studiato su cellule umane in coltura esposte a diversi tipi di agenti ossidanti.
Le cellule sono state pretrattate per 2 ore con GTP e quindi esposte per 30 minuti ad una soluzione di fumo di sigaretta od a perossido d’idrogeno. Il pretrattamento con GTP ha bloccato la formazione di rotture di legami tra le 2 eliche del DNA e di LLP indotti sia dal fumo di sigaretta che dal perossido d’idrogeno. I GTP inoltre hanno ridotto la tossicità globale del perossido d’idrogeno determinata in base alla crescita delle cellule dopo
l’esposizione. Questi risultati indicano quindi che i GTP inibiscono la formazione di DNA-addotti (25).
Il tè nero si ricava dalla biotrasformazione delle catechine del tè verde in teaflavine e tearubigine ed ha anch’esso mostrato proprietà antiossidanti. Sia il tè nero che le sue singole catechine hanno inibito, in maniera ancora più efficiente rispetto al tè verde, la produzione di ossido nitrico ed anione superossido di in macrofagi peritoneali murini attivati (26).
Vitamina E
I lipidi costituiscono il 90% del surfattante polmonare e sono estremamente sensibili alla ossidazione; il più importante antiossidante lipofilo nel polmone è la vitamina E (Vit.E). La Vit.E inoltre protegge le cavie di laboratorio dal danno polmonare indotto dalla iperossia (27).
La Vit.E raggiunge lo spazio alveolare come costituente integrale del surfattante prodotto dalle cellule epiteliali di II tipo,mentre viene trasportata nel plasma dallelipoproteine.Non è tuttavia ancora chiaro a quale concentrazione cellulare la vit.Erifletta uno stress ossidativo o una sufficiente protezione dei lipidi e delle proteine di membrana (27).Comunque la pre-somministrazione di vit.E succinato a ratti successivamente
esposti ad estratto acquoso di fumo di tabacco (STE) ha determinato una diminuzione significativa della produzione di ossido nitrico (NO) in risposta all’ STE nei macrofagi peritoneali isolati in coltura(28).
Licopene
E’ stata riportata l’azione protettiva del licopene, un pigmento retinoide rosso contenuto nei pomodori, nei linfociti umani nei confronti dei ROS ossigeno singoletto e biossido d’azoto dopo il mantenimento di una dieta ricca di licopene per un periodo di 14 giorni (29). Questo studio rafforza l’interesse corrente verso i carotenoidi della dieta rispetto alle loro possibili proprietà preventive
.Idrossitirosolo
Le acque “a perdere” derivanti dalla macinazione delle olive sono ricche di antiossidanti fenolici, tra cui l’idrossitirosolo; la somministrazione di un estratto di questo bioprodotto (5 mg/kg per 4giorni) a ratti esposti a fumo di tabacco per 20 minuti al giorno ha determinato una notevole diminuzione del marker di
stress ossidativo preso in considerazione, vale a dire la concentrazione di iso-prostaglandina (PG) F(2alpha) (un prodotto della perossidazione lipidica di membrana) nelle urine (30).
Conclusioni
La chemioprevenzione dei tumori sbasa sulla possibilità di interferire con una o più fasi della cancerogenesi.
I vari composti chimici passati in rassegna hanno mostrato attività potenzialmente anti-inizianti e/o anti-promuoventi la cancerogenesi e, in futuro, potrebbero pertanto essere utilizzati come agenti chemiopreventivi.
Obiettivo degli agenti chemiopreventivi è prevenire la formazione di quelle alterazioni a carico del DNA che rappresentano le fasi più precoci della patogenesi del carcinoma polmonare e forse anche delle malattie degenerative croniche del polmone, in cui alterazioni deglistessi biomarker possono essere rilevate.
Fino ad ora i trial clinici non hannomostrato risultati positivi (33); tuttaviadiversi studi preliminari e alcuni studi
animali pongono l’attenzione sulla NACcome uno dei più promettenti sistemi antiossidanti nella prevenzione oncologica nei soggetti a rischio. E’ pertanto auspicabile che le future sperimentazioni cliniche si concentrino su popolazioni di soggetti ex-fumatori, che continuano ad essere ad alto rischio per lo sviluppo del cancro del polmone anche dopo aver cessato di fumare.
Un’altra interessante prospettiva è quella di combinare diversi componenti antiossidanti allo scopo di potenziare l’effetto chemiopreventivo globale.
